Fiche Résumé 05-AEP-02

Depuis quelques années, des alertes ont été publiées sur la présence, dans les eaux, de molécules qui reproduisent, lors de leur absorption par la faune environnante, l'action des hormones sexuelles (oestrogènes) ou en modifient l'activité. Ces molécules, qui sont dénommées "modulateurs endocriniens", peuvent de ce fait augmenter ou au contraire inhiber l'action des hormones naturelles des organismes. Elles sont donc à l'origine de perturbations du développement et de la reproduction. Sur l'homme, elles sont supposées être responsables de la formation de certains cancers hormonodépendants (sein, testicules, prostate).

Parmi les composés concernés se retrouvent les molécules hormonales naturelles ou celles utilisées dans les contraceptifs oraux et dans la prévention des troubles liés à la ménopause. D'autres micropolluants classiquement retrouvés dans les eaux ont également des effets plus ou moins importants comme par exemple les pesticides organochlorés, les triazines, les alkylphénols, les polychlorobiphényls, les phtalates, etc.

Un 1er programme de recherche (3 ans) a été consacré à la mise au point de deux méthodes (in vivo et in vitro) de détermination de l'activité oestrogénique des eaux, puis au test de ces deux méthodes sur des eaux naturelles. Les résultats ont montré que, en terme d'effets biologiques, le danger potentiel est "limité" vis-à-vis des risques sanitaires. Mais il est cependant possible que les effets oestrogéniques soient masqués par des molécules à effets anti-oestrogéniques présents dans le même échantillon. Les divers polluants peuvent alors apporter chacun leurs effets biologiques respectifs agissant parfois en synergie ou en antagonisme.

Pour pouvoir conclure sur les risques sanitaires, le nouveau programme d'étude (3 ans) propose de développer une approche plus globale. Il mettra en œuvre une palette élargie de méthodes d'approche biologiques (mesure de l’effet oestrogénique, génotoxique, perturbateur des hormones thyroïdiennes) ; cherchera à isoler et identifier les micropolluants à l'origine des activités toxiques ; mettra en évidence les relations entre ces micropolluants et ceux à effets perturbateurs endocriniens et étudiera l'évolution du potentiel de toxicité au cours des étapes majeures de potabilisation (notamment l’ozonation).

Extraction des échantillons
Afin de préparer aux mieux les échantillons destinés aux tests biologiques, il faut concentrer une gamme, la plus large possible, de micropolluants organiques potentiellement présents. L’extraction en phase solide (SPE) est la méthode de référence qui répond à la majorité des critères. Les cartouches SPE OASIS® HLB (Hydrophilic Lipophylic Balance) ont alors été choisies à partir de la littérature et le protocole d’extraction optimisé. Ces cartouches, composées d’un copolymère de divinylbenzène fonctionnalisé par des groupements N-vinylpyrrolidone, ont permis d’obtenir un rendement d’extraction supérieur à 85 % pour la plupart des composés étudiés : bisphénol A (plastifiant à effets oestrogènes), éthinyl-oestradiol (oestrogène de synthèse et contraceptif oral), fluoxétine (antidépresseur Prozac), ibuprofène (anti-inflammatoire souvent retrouvé dans les eaux), oestriol (principal métabolite oestrogène de l’oestradiol) et 17B-oestradiol (hormone naturelle). Enfin, le solvant DMSO, compatible avec la survie des cellules, a été choisi pour la récupération de l’extrait destiné aussi bien aux tests biologiques qu’à l’analyse (HPLC).

Test “oestrogénique” (lignée cellulaire MELN)
Le test in vitro de détermination des effets oestrogéniques utilise la lignée cellulaire MELN (cancer du sein humain). Ces cellules, aptes à proliférer en réponse aux oestrogènes, contiennent de la luciférase de luciole qui réagit de façon proportionnelle à la quantité d’hormone naturelle ou de perturbateurs endocriniens présents dans l’échantillon à analyser. La mesure de la luminescence permet de calculer l'activité oestrogénique globale à partir d'une gamme étalon obtenue avec le 17ß-oestradiol. Ce test, rapide, sensible et reproductible, est désormais optimisé

Test “thyroïdien” (lignée cellulaire PC-12-6c)
Un nouveau test permettant d’évaluer les effets perturbateurs qu’ont les micropolluants sur les récepteurs aux hormones thyroïdiennes a ensuite été développé. Ce type de test n’existe pas sur le marché et est moins décrit dans la littérature que celui relatif aux effets oestrogéniques. Pourtant, les hormones thyroïdiennes jouent un rôle sur le développement normal du cerveau, du squelette, du système musculaire... Le test a été construit de façon à pouvoir être utilisé sur les mêmes échantillons que ceux destinés au test oestrogénique. Le modèle cellulaire choisi est la lignée PC-12-6c, issue d’un cancer des glandes surrénales de rats et modifiée pour y introduire des récepteurs aux hormones thyroïdiennes. Le travail de mise au point consiste à introduire des éléments de réponse permettant, en cas d’activation ou de blocage du récepteur, d’obtenir un signal identifiable (dosage de la réponse par luminescence). Ce test in vitro est innovant et original et sa mise au point est pratiquement achevé.

Application à des échantillons environnementaux
Les deux tests ont ensuite été utilisés sur les eaux “entrée-sortie” des stations d’épuration (STEP) de Colombes et de Valenton. Un essai de viabilité MTT a été ajouté pour interpréter les effets toxiques en présence d’éventuels inhibiteurs qui perturbent le métabolisme des cellules et ne permettent donc pas de conclure sur les effets perturbateurs endocriniens. La réponse des tests peut alors être rapportée uniquement au nombre de cellules viables. Les premières conclusions montrent un effet oestrogène toujours avéré et un effet inhibiteur “thyroïdien”.

La suite de l’étude devra finir l’optimisation des tests biologiques et apporter des éléments plus complets sur les mécanismes mis en jeu dans les mélanges de perturbateurs endocriniens.