Fiche Résumé 13-AEP-01

Il est reconnu aujourd'hui que les taux de désinfection appliqués en production d’eau potable sont insuffisants pour éliminer certaines bactéries pathogènes (2 à 3 fois trop faibles), notamment celles potentiellement responsables de maladies respiratoires et appartenant aux genres Legionella ou Mycobacterium. Les bactéries soumises à cette agression chimique se retrouvent alors dans un état de stress qui se traduit par une perte de cultivabilité : les bactéries sont dites "viables non cultivables" (VBNC) car elles ne peuvent plus être détectées par les méthodes classiques de culture sur gélose mais restent néanmoins détectables par des méthodes alternatives capables de mesurer la viabilité.

Cet état de stress peut disparaître dans le réseau de distribution et engendrer le développement d'une forme de résistance des bactéries pathogènes. Ces bactéries peuvent redevenir cultivables dans certaines conditions, notamment au contact des amibes libres qui sont présentes dans la plupart des réseaux d’eau potable, comme celles appartenant aux genres Acanthamoeba, Naegleria ou Hartmannella. La capacité des bactéries pathogènes à infecter des amibes est généralement considérée comme une expression de leur virulence donc de leur capacité à infecter également les cellules humaines.

L'objectif de l'étude est de tenter d'apporter des réponses aux nombreuses questions liées à ce phénomène : la désinfection aux taux habituels d'application protège-t-elle réellement contre ces bactéries pathogènes ? Les bactéries viables non cultivables sont-elles infectieuses pour l'Homme ? La désinfection les rend-elles plus ou moins infectieuses ? Quelles sont les conséquences pour les pratiques de désinfection ?

La première phase de l’étude a été consacrée à une synthèse bibliographique sur les effets des désinfectants chimiques vis-à-vis des bactéries. Il en ressort que :
- les bactéries sont capables de mettre en oeuvre un ensemble de mécanismes de défense lorsqu’elles sont en état de stress oxydatif (systèmes enzymatiques ou non permettant de neutraliser les désinfectants, protéine permettant de protéger l’ADN cellulaire),
- les bactéries sont capables de se protéger en se logeant à l’intérieur des biofilms ou des kystes amibiens, et pour certaines d’entre elles à l’aide de mécanismes de sporulation,
- aucune publication n’a été identifiée sur l’infectiosité des bactéries ayant subi un stress oxydatif ce qui justifie la réalisation d’une étude expérimentale pour évaluer l’infectiosité pour l’homme de bactéries pathogènes présentes à l’état viable non cultivable dans les eaux désinfectées.

La deuxième phase de l’étude s’est poursuivie par des essais en laboratoire utilisant un seul biocide (HOCl), deux souches de L. pneumophila (une pathogène et une non pathogène) et une souche d’Escherichia coli (comme modèle). L’adaptation pour Legionella pneumophila de la méthode microscopique automatisée, développée initialement pour Escherichia coli a été réalisée. Cette méthode, qui utilise un milieu de culture différent de celui utilisé par la méthode normalisée, permet d’observer et tester en quelques heures la réaction de bactéries à un stress oxydant, en mesurant la capacité de chaque cellule, prise individuellement, à former une micro-colonie. Les résultats obtenus sur E. coli avaient démontré que l’état viable non cultivable observé lors de la mise en culture sur milieu de culture standard était dû à un stress oxydant généré par le millieu de culture lui-même.

La comparaison des dénombrements de L. pneumophila par la méthode de culture normalisée avec la méthode des micro-colonies après application de doses croissantes d’acide hypochloreux (HOCl) confirme que la méthode de référence sous-estime largement le nombre de bactéries vivantes. En pratique, le facteur CT (concentration x temps) devrait être multiplié par deux ou trois pour atteindre réellement l’abattement mesuré à l’aide de la méthode de culture normalisée. La détermination précise de ce facteur CT nécessaire à l’abattement des bactéries n’est pas possible avec la méthode microscopique des micro-colonies, dans l’état actuel de son développement, du fait de son manque de reproductibilité.

La perte de viabilité mesurée à l’aide de la méthode microscopique des micro-colonies est liée à la perte d’intégrité membranaire des bactéries, ce qui confirme la pertinence de cette méthode pour l’évaluation de la viabilité. Mais cette méthode nécessite pour l’observation microscopique une densité bactérienne élevée, limitant sa sensibilité et entraînant une forte consommation de désinfectant, ce qui impose des conditions trop éloignées de la réalité rencontrée dans la production d’eau potable.

La troisième phase de l’étude prévoyait d’évaluer l’infectiosité (aptitude à se développer dans un organisme) et la virulence (aptitude à se développer dans un organisme et provoquer une maladie) de L. pneumophila avant et après désinfection. Cependant, les essais n’ont pas permis d’aboutir ni pour l’infectiosité (impossibilité d’infecter in vitro les macrophages humains testés), ni pour la virulence (instabilité du plasmide “virulence” intégré dans la souche et impossibilité de cultiver la souche porteuse de ce plasmide).

Dans un objectif de sécurisation vis-à-vis des bactéries pathogènes et en attendant la mise au point d’une méthode optimisée de contrôle de la qualité de l’eau, comme par exemple l’amélioration des milieux utilisés dans les méthodes de culture pour limiter le stress oxydatif sur gélose, un facteur multiplicatif de 3 pourrait être appliqué aux CT publiés dans la littérature.