Fiche Résumé 11-AEP-09

Depuis quelques années, des alertes ont été publiées sur la présence, dans les eaux, de molécules qui reproduisent, lors de leur absorption par la faune environnante, l'action des hormones ou en modifient l'activité. Ces molécules, qui sont dénommées "modulateurs” ou “perturbateurs” endocriniens, peuvent de ce fait augmenter ou au contraire inhiber l'action des hormones naturelles des organismes. Elles sont donc à l'origine de perturbations du développement et de la reproduction. Sur l'homme, elles sont également suspectées être responsables de la formation de certains cancers hormonodépendants (sein, testicules, prostate).

Parmi les composés concernés se retrouvent les molécules hormonales naturelles et celles utilisées dans les contraceptifs oraux et dans la prévention des troubles liés à la ménopause. En complément, d'autres micropolluants classiquement retrouvés dans les eaux sont clairement responsables d'effets plus ou moins importants comme les pesticides organochlorés, les triazines, les alkylphénols, les polychlorobiphényls, les phtalates, etc.

Dans le cadre de la surveillance de la qualité des eaux naturelles mais aussi dans le cadre de l'optimisation de l'efficacité des filières de production d'eau potable vis-à-vis des perturbateurs endocriniens, il est nécessaire de développer un protocole d'évaluation rapide, fiable, peu onéreux, sensible et pouvant être automatisé. Les cultures cellulaires, utilisées jusqu'alors dans les tests in vitro, ne se prêtent pas à un système automatisable, compte tenu de la lourdeur de leur entretien, de leur fragilité, de leur demande importante en main d'œuvre, du délai relativement important de réponse et de leur coût. Les systèmes in vivo ne permettent pas de décrire les mécanismes d’action et sont encore plus lourds car ils nécessitent d'entretenir des élevages. Il existe bien quelques exemples de systèmes automatisés avec des poissons mais plutôt dans le domaine de la toxicité aiguë. Il est donc intéressant de tenter de développer un outil basé sur un protocole analytique biochimique et donnant une réponse sur la perturbation de différents types de récepteurs hormonaux en contact avec divers perturbateurs endocriniens. L'avantage de ce type d'outil serait d'éviter l'utilisation de matériel "vivant" (cellules, levures ou animal) ce qui permettrait entre autres de progresser dans la possibilité de mettre ce genre d'analyses entre des mains moins expertes.

L'objectif du projet est donc de développer un outil biochimique d'aide à la gestion des installations de production d'eau potable, donnant une réponse sur la perturbation de différents types de récepteurs hormonaux en contact avec des polluants à effets interférents. Cet outil devra être simple, automatisable, rapide, sensible et répondre à une large gamme de composés perturbateurs évitant ainsi la multiplication des essais en parallèle et le surcoût analytique des méthodes chromatographiques.

L’outil biochimique est basé sur l’évaluation de la perturbation, par des polluants, des différents types de récepteurs hormonaux en utilisant un signal de polarisation de fluorescence. La polarisation de la fluorescence retranscrit le recrutement ou le relargage, par le récepteur, des protéines régulatrices du système hormonal. Ces protéines régulatrices de petite taille, marquées au préalable par un fluorophore, sont très mobiles lorsqu’elle sont libres en solution (création d’une forte dépolarisation de la lumière émise par le fluorophore) et moins mobiles lorsqu’elles sont liées à une macromolécule comme le récepteur (polarisation de la lumière diffusée donc absence de signal). Lorsque l’hormone naturelle se fixe sur le récepteur, elle induit une modification de la configuration stérique de ce récepteur qui favorise le recrutement des protéines régulatrices (appelées co-activateurs) au détriment des protéines régulatrices (appelées co-répresseurs) qui sont alors relarguées. Ce mécanisme entraîne une modification du signal de polarisation de la fluorescence. Lorsqu’un polluant perturbateur endocrinien se fixe sur le récepteur à la place de l’hormone naturelle, il modifie le fonctionnement normal de recrutement/relargage des protéines régulatrices (accentuation ou inhibition ou effet inverse) et le test permet, par la réponse de la polarisation de fluorescence, d’identifier le mécanisme qui se produit alors (relargage du co-répresseur en absence de l’hormone naturelle, recrutement du co-activateur en absence de l’hormone naturelle, relargage du co-activateur en présence de l’hormone naturelle...).

La première phase de l'étude a permis la construction du test par la production et la purification des éléments biochimiques nécessaires à son fonctionnement ainsi que par l’optimisation des concentrations de chaque élément. Ce travail a été réalisé pour un récepteur hormonal thyroïdien et un récepteur qui répond à un spectre plus large de polluants. Puis différents polluants ont été testés sur l’un et/ou l’autre des deux récepteurs : TBBPA (tétrabromobisphénol-A) et pentachlorophénol (PCP) qui sont des perturbateurs thyroïdiens ; nonylphénol linéaire (4nNP) et bisphénol-A qui sont des perturbateurs oestrogéniques et faiblement thyroïdiens. Les résultats obtenus lors de l’analyse de produits purs dans une matrice sans interférence (eau synthétique) ont été très encourageants dans le cas du récepteur thyroïdien : le test permet la mesure fiable des interactions entre des perturbateurs endocriniens et les récepteurs hormonaux. Les résultats sont par contre moins concluants pour l’autre récepteur qui sera donc abandonné (réponse pas assez sensible).

La seconde phase de l’étude prévoyait la mise au point du test avec un troisième récepteur (cette fois-ci oestrogénique) et une validation sur des échantillons réels de la région parisienne. Cependant, l’étude a été arrêtée prématurément car les résultats ont montré que le mode de détection par fluorescence utilisé par le test biochimique est confronté à des interférences liées à un phénomène d’autofluorescence produite par la matrice environnementale. En conséquence, il pourrait être envisagé de réorienter le programme de recherche en utilisant une détection par mesure de luminescence ce qui impliquerait le changement total de la nature des réactifs utilisés et l’étude de la possibilité de fixer sur les co-facteurs des éléments capables de générer une protéine active de type luciférine.